(본 내용은 김동욱대표님이 수행한 과학기술부 국책과제 보고서로 69개의 사진 및 그림을 포함하고 있으며 다음은 그 주요부분을 발췌한 것이다.
보고서의 전체적인 내용은 아래의 제목을 검색하면 알 수 있다.)
(제목)
전분화능 줄기세포로부터 중뇌 흑질부 특이적 도파민 신경세포의 효율적 분화법 개발을 통한 신경계 질환 세포치료 원천기술 개발
그림2
최근 몇 년간 도파민을 분비할 수 있는 세포를 선조체에 이식하여 도파민 결핍을 해결하고자 하는 세포치료법이 고안/시도되었다. 발생중인 쥐 배아의 중뇌 조직에서 분리된 도파민 전구세포를 파킨슨병 동물모델에 이식하여 파킨슨 유사 증상의 회복을 유도한 실험 결과는 세포 이식을 통한 파킨슨병 치료 가능성을 실험적으로 증명하였다. 이러한 결과를 바탕으로 최근 몇몇 선진국에서 낙태아의 중뇌 조직을 환자에게 이식하여 환자의 증상이 유의하게 회복되었다는 결과가 빈번하게 보고되고 있다. 이러한 임상시험들의 유효성이 좀 더 신중하게 평가되어야 할 필요가 있지만 인간에서도 도파민 신경세포 이식을 통한 파킨슨병의 세포치료 가능성은 한층 더 높아졌다는 데에는 의심할 여지가 없어 보인다.
그림3
최근 미국 슬로언 캐털링 연구소의 연구팀이 Nature지에 기고한 연구결과에 따르면 실제 파킨슨병 환자에서 소실되는 중뇌 부위의 도파민 신경세포의 발생과정과 유사한 방법으로 인간 배아줄기세포로부터 분화시킨 도파민 신경세포가 파킨슨병 동물모델에서 획기적으로 파킨슨 유사 증상을 치료할 수 있었다고 하였다 (Kriks et al. 2011). 이 연구는 파킨슨병과 직접 관련된 (relevant) 도파민 신경세포가 파킨슨병 세포치료에 훨씬 더 적합할 세포일 것이라는 중요한 메시지를 전달하고 있다. 실제 척추동물의 뇌에는 다양한 부위에서 도파민 신경세포가 존재하며 각각의 부위에서 각기 다른 세포생리학적 특성을 통해 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히 도파민 신경세포체들이 모여 있는 중뇌부위를 좀 더 자세히 살펴보면 크게 적색핵후구역 [retrorubral field (RRF), 이하 A8 부위], 흑질부 [substantia nigra pars compacta (SNpc), 이하 A9 부위]과 배쪽바닥핵 [ventral tegmental area (VTA), 이하 A10 부위]의 세부분으로 나눌 수 있다 ([그림 3]참조). 특히 중뇌 흑질부 (A9부위)의 도파민 신경세포의 경우가 전술한 바와 같이 선조체로 종지하여 실제 운동 조절기능을 담당하고, 파킨슨병 환자의 뇌에서 선택적으로 사멸하게 되는 세포이다. 그에 반해 파킨슨병 환자에서 A8 부위나 A10 부위의 도파민 신경세포의 사멸이 크게 유의하지 않은 수준으로 알려져 있어, 실제 파킨슨병과 관련된 도파민 신경세포는 중뇌 흑질부 (A9부위)에 존재하는 도파민 신경세포라고 할 수 있다.
그림4
중뇌 흑질부 (A9부위)의 특성을 가진 도파민 신경세포의 이식이 다른 부위의 도파민 신경세포 이식보다 훨씬 파킨슨병 증상의 경감에 효과적인 것을 보여주는 좋은 선행 연구 결과가 있다. 발생중인 쥐 배아에서 A9부위와 A10 부위의 도파민 신경세포를 선택적으로 분리한 후 파킨슨 유사증상 동물모델에 이식하였을 때 이식 약 12주 후의 증상회복 양상이 A10부위 도파민 신경세포보다 A9부위 도파민 신경세포를 이식했을 때 좀 더 뚜렷하게 나타났으며 (아래 [그림 4]참조), 숙주의 신경세포와도 잘 연접하고 있는 모습이 관찰되었다. 이러한 연구 결과는 중뇌 흑질부 (A9부위)의 도파민 신경세포가 파킨슨병을 위한 세포치료에 가장 적합한 재료라는 것을 직접적으로 증명해 주고 있다.
그림14
도파민 신경세포에서 중뇌 흑질부 (A9부위) 특이적 마커인 Pitx3와 Girk2의 유전자 수준에서의 발현이 대조군에 비해 현저히 높아짐을 확인하였고, A10 특이적 마커인 Calbindin은 BIO를 처리한 후 분화시킨 신경세포에서 대조군에 비해 현저히 낮아짐을 확인.중뇌성을 보유한 신경전구세포를 성숙한 도파민 신경세포로 분화시킨 후 중뇌성을 보유한 도파민 신경세포로 만들어졌는지의 확인을 위해 다양한 위치 특이적 마커들로 중뇌성의 여부를 확인. TH⁺/En1⁺ 세포를 면역염색법으로 확인했으며 이들 신경세포가 기능적으로 활성화 될 수 있는지의 여부를 면역염색, HPLC, 전기생리학적 방법을 통하여 확인함.
그림15
중뇌 도파민 전구세포의 성숙한 도파민 신경세포로의 분화. 중뇌 도파민 전구세포에서 발현하는 LMX1A와 FOXA2가 성숙한 도파민 신경세포로 분화 후에도 발현을 유지함 (A). 도파민 신경세포의 마커인 TH와 신경세포의 마커인 TUBB3가 동시에 발현하는 세포를 확인함으로써 도파민 신경세포임을 확인하였으며 (B), 또한 성숙한 신경세포의 마커인 NeuN이 TUBB3와 동시에 발현하는 것을 확인함으로써 도파민 신경세포가 성숙한 신경세포임을 확인함
본 연구팀에서 확립한 중뇌 흑질부 (A9부위) 특이적 도파민 신경세포 분화법을 이용하여 유도분화한 중뇌 도파민 전구세포를 in vitro 상에서 신경세포로의 분화를 진행하여 성숙한 중뇌 도파민 신경세포의 특성을 확인함. 중뇌 도파민 전구세포 단계에서 부터 성숙한 도파민 신경세포까지 계속해서 발현하는 FOXA2, LMX1A의 발현을 확인하였으며, 또한 도파민 신경세포 마커인 TH와 신경세포 마커인 TUBB3가 동시에 발현하는 것을 확인함. TUBB3 양성 세포가 성숙한 신경세포에서 발현하는 NeuN을 동시에 발현함을 확인함으로써 분화 프로토콜을 이용하여 인간 전분화능 줄기세포로부터 성숙한 중뇌 도파민 신경세포로의 분화 가능함을 확인함.
그림21
인간 배아줄기세포 (H9)외에 인간 역분화 줄기세포 (HDF-epi3)에서도 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 세포의 유도분화를 증명하여, 본 분화법이 인간 전분화능 줄기세포에서 일반적으로 적용가능하다는 것을 확인하였음. 분화과정 중에 Wnt와 SHH 신호를 화학작용물질로 조절함으로써 중뇌마커인 EN1, 신경관의 Floor plate마커인 FOXA2, 그리고 도파민 전구세포 마커인 LMX1A가 모두 발현하는 중뇌 도파민 전구세포의 발생을 인간 역분화 줄기세포에서 유도할 수 있음을 확인하였음. CR, CHIR99021
확립한 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 신경세포 분화법이 인간 배아줄기세포 뿐만 아니라 인간 역분화 줄기세포에서도 적용이 가능함을 확인함.
그림34
세포 증식이 일어나는 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 전구세포 단계에서 LMX1A의 발현 여부에 따라 세포를 분리하고, 세포 증식이 더 이상 일어나지 않는 성숙한 중뇌 도파민 신경세포 단계에서 PITX3의 발현 여부에 따라 세포를 분리함. 분리한 세포 그룹을 전사체 분석을 통하여 분자적 특성을 파악함
그림39
확보한 중뇌 도파민 전구세포 특이적 세포 표면마커를 이용하여 세포 분리를 시도함. 세포 분리 시 세포의 사멸을 최소화하기 위해 물리적 스트레스가 상대적으로 낮은 MACS (magnetic activated cell sorting) 방법을 이용하여 세포를 분리함. 개발한 도파민 전구세포 특이적 마커를 이용하여 분리한 세포는 대부분의 세포가 KI67을 발현하여 세포증식이 이루어지고 있는 세포이며, 중뇌 도파민 전구세포에서 발현하는 LMX1A와 FOXA2를 발현함.
그림42
파킨슨병 동물모델에 이식할 세포 단계를 확립을 위한 연구를 진행함. 세포 이식을 위한 첫 번째 과정인 효소에 의한 단일세포 분리 (enzymatic dissociation) 과정에서 도파민 전구세포와 도파민 신경세포에 주어지는 스트레스에 각 세포의 저항성이 다르게 나타나는 것을 확인함. 도파민 전구세포 단계 (분화 20일)에서는 효소에 의한 단일세포 분리 과정 중 사멸하는 세포는 전체 중 약 5%로 확인되었으나, 도파민 신경세포 단계 (분화 40일) 에서는 이 과정동안 전체 중 약 18%의 세포가 사멸함.
인간 전분화능 줄기세포로부터 중뇌 도파민 신경세포로의 분화법을 이용한 분화 과정 중 파킨슨병 동물모델에 이식할 세포 단계를 확립을 위한 연구를 진행함. 도파민 전구 세포 단계와 도파민 신경세포 단계의 세포를 각각 파킨슨병 동물모델에 이식하였을 때, 세포의 생존 측면에서 차이가 나타나는 원인을 확인하고자 하였음. 세포 이식을 위한 첫번째 과정인 효소에 의한 단일세포 분리 (enzymatic dissociation) 과정에서 도파민 전구세포와 도파민 신경세포에 주어지는 스트레스에 각 세포의 저항성이 다르게 나타나는 것을 확인함. 도파민 전구세포 단계 (분화 20일)에서는 효소에 의한 단일세포 분리 과정 중 사멸하는 세포는 전체 중 약 5%로 확인되었으나, 도파민 신경세포 단계 (분화 40일) 에서는 이 과정동안 전체 중 약 18%의 세포가 사멸함. 따라서 도파민 전구세포가 이식에 적합한 단계의 세포라는 결론을 얻음.
그림43
중뇌 도파민 전구세포인 LMX1A 양성세포 이식 16주 후의 생존하는 이식편 (graft)의 크기를 확인할 수 있음 (A). 중뇌 도파민 신경세포인 PITX3 양성세포 이식 16주 후의 생존하는 이식편 (graft)의 크기를 LMX1A 양성세포 이식 후 조직 크기와 비교할 수 있음 (B). LMX1A 양성세포 이식 조직에서 인간세포 마커인 HNA 양성인 세포가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포로 분화하였음을 확인함 (C). 이식한 LMX1A 양성세포 (EGFP 양성세포)가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포로 분화하였음을 확인함 (D). PITX3 양성세포 이식 조직에서 인간세포 마커인 HNA 양성인 세포가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 세포임을 확인함 (E). 이식한 PITX3 양성 이식세포 (mCherry 양성세포)가 TH를 발현하는 성숙한 도파민 신경세포임을 확인함
(F)중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 전구세포 단계에서 LMX1A 양성세포 (EGFP 양성세포)를 분리하고, 중뇌 흑질부 (A9부위) 도파민 신경세포 단계에서 PITX3 양성세포(mCHERRY 양성세포)를 분리하여 6-OHDA 손상 파킨슨병 랫트 모델에 이식함. 세포이식 16주 후에 조직학적 분석 결과, 이식한 세포가 파킨슨병 동물모델에 생존하여 도파민 신경세포 마커인 TH를 발현하고 있는 것을 확인함. 도파민 전구세포 단계와 도파민 신경세포 단계에서 이식하였을 때 이식편 (graft) 크기의 차이가 나타나는 것을 확인하였고, 이것으로 이식하는 세포의 분화 단계에 따라 이식 시의 세포 생존에 차이가 나타남을 알 수 있음. 즉, 도파민 전구세포 단계의 세포가 이식 후 세포의 생존 측면에서 이식에 적합하다는 결과를 얻었으며, 이것은 in vitro에서의 연구결과와 상응함.
그림44
코리더 행동분석 실험법의 확립 (Corridor test). 그림과 같이 간격을 두어 슈가 펠릿 (45 mg)을 통에 담아 왼쪽/오른쪽 어느 쪽을 섭취하는지를 5분 동안 확인함. 6-OHDA 손상 파킨슨 랫트 모델은 오른손을 좀 더 자유롭게 쓰게 되는데 실험을 진행하면 오른쪽에 둔 펠릿에 접근이 왼쪽보다 증가함. 자가행동분석 실험은 약물 유도 행동분석 실험법과는 달리 약물에 노출되지 않은 상황에서의 행동변화를 관찰할 수 있음. 하지만 현재의 6-OHDA 손상 파킨슨 랫트 모델을 평가하는 자가행동분석 실험들의 단점은 반복적으로 실험이 진행되면 랫트가 학습하게 됨으로써 행동을 멈추게 되어 행동변화의 유의성의 정확도가 떨어지게 되므로 암페타민 유도 회전운동 실험법의 보조적 실험으로 사용하는 경우가 많았음. 코리더 실험법은 슈가 펠릿이라는 보상을 도입해서 쥐에게 행동해야 하는 이유를 주기 때문에 기존의 자가행동분석 실험의 단점을 보완한 실험임
본 연구실에 기 확립되어있던 파킨슨병 랫트 모델의 행동분석 실험법의 단점을 보완하기 위해 추가적으로 코리더 행동분석 실험법 (corridor test)을 도입하여 확립함. 기존에 사용하던 약물 유도 행동분석 실험법은 암페타민을 사용하여 도파민 신경세포를 활성화시켜 나타나는 랫트의 행동을 확인하는 암페타민 유도 회전운동 실험법 (amphetamineinduced rotation test)으로, 동물의 의지를 배제하고 도파민 신경세포의 활성으로 나타나는 행동을 확인할 수 있으나, 인위적인 도파민 신경세포의 활성이라는 단점이 있음. 자가행동분석 실험법으로는 실린더 실험법 (cylinder test)을 사용하고 있는데, 약물 유도 행동분석법과 달리 약물에 노출되지 않은 상황에서의 행동변화를 관찰할 수 있으나, 반복적으로 실험이 진행되면 랫트의 학습이 이루어져 일정시간 이후에는 운동을 멈추게 되어 행동 변화 유의성의 정확도가 떨어지게 됨. 따라서, 코리더 실험법은 슈가 펠릿 (sugar pellet)이라는 보상을 도입해서 랫트에게 행동해야 하는 이유를 주기 때문에 기존의 자가행동분석 실험의 단점을 보완한 실험법이라 할 수 있음.
그림45
로테이션 테스트와 실린더 테스트
중뇌 특이적 도파민 신경세포를 랫트 파킨슨병 모델에 이식하였을 시 행동검사를 통하여 운동기능이 회복됨을 확인 (A) Amphetamine 에 의해 유도된 로테이션 테스트 (B) ipsilateral paw 의 사용에 대한 실린더 테스트 결과
확립한 인간 전분화능 줄기세포로부터 중뇌 도파민 신경세포로의 분화법을 이용하여 유도분화한 중뇌 도파민 전구세포를 랫트 파킨슨병 모델에 이식하여 세포의 효과를 확인함.
그림46
MPTP를 5일간 투여하여 확립한 마모셋 영장류 파킨슨병 모델에 유도분화한 중뇌 도파민 전구세포를 선조체에 이식 후 행동 개선을 확인함. 세포 이식 후 마모셋 모델에서 나타났던 사지강직, 과도한 눈 깜빡임 등의 증상이 완화되는 것을 확인함
확립한 인간 전분화능 줄기세포로부터 중뇌 도파민 신경세포로의 분화법을 이용하여 유도분화한 중뇌 도파민 전구세포를 영장류 파킨슨병 모델인 마모셋 파킨슨병 모델에 이식하여 세포의 효과를 확인함. 5일간 MPTP를 투여하여 마모셋 파킨슨병 모델을 확립하고 4주 후 분화 유도한 도파민 전구세포를 선조체에 이식하여 행동개선을 확인함. MPTP 투여 후 약 1주 후부터 사지 강직, 진전 그리고 과도한 눈 깜빡임 등 증상이 심각해지는 것을 확인하였으며, MPTP 투여 후 28일째 도파민 전구세포를 이식하여 모델 제작 시 나타난 증상이 완화되는 것을 확인함.
그림47
영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인 18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 확인함
도파민 전구세포 이식 후 나타나는 행동개선이 이식한 세포에 의해 나타난 결과라는 것을 확인하기 위해 영상진단학적 평가를 수행함. 영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 획득함. MPTP 투여 전 선조체 부위에 강한 발현을 보이다가 MPTP 투여 후 2주째 선조체 부위에 발현이 현저하게 감소하여 거의 발현되지 않았음. 도파민 전구세포의 이식 후 18주째부터 발현량이 증가함을 관찰하였으며, 24주째 발현량이 18주째보다 더 증가한 양상이 관찰되었음.
그림48
영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인 18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 획득 후 분석함. 촬영 시점별로 모델군과 효능군 사이를 비교하였을 때 세포 이식 후 18주부터 유의한 차이가 확인됨
도파민 전구세포 이식 후 나타나는 행동개선이 이식한 세포에 의해 나타난 결과라는 것을 확인하기 위해 영상진단학적 평가를 수행함. 영상진단학적 평가를 위해 dopamine transporter (DAT)와 관련된 동위원소 추적자인18F-FP-CIT를 투여하여 PET 영상을 획득함. MPTP 투여 전 선조체 부위에 강한 발현을 보이다가 MPTP 투여 후 2주째 선조체 부위에 발현이 현저하게 감소하여 거의 발현되지 않았음. 도파민 전구세포의 이식 후 18주째부터 발현량이 증가함을 관찰하였으며,F-24주째 발현량이 18주째보다 더 증가한 양상이 관찰되었음.
그림49
인간 전분화능 줄기세포로부터 신경전구세포로의 공통적용 분화법을 (위) 기반으로 분화한 신경전구세포의 이질 혼합성을 파악하고 그의 원인 중 하나인 신경능선세포의 존재를 관찰하였음 (아래)
공통적용 분화법을 기반으로 신경전구세포 및 도파민 신경세포로의 분화 유도 시 발생할 수 있는 세포의 이질 혼합성을 파악하고, 파킨슨병에 적용할 도파민 신경세포를 규명하고 순수분리 하고자 함. 파킨슨병의 세포치료에 필요한 도파민 신경세포로 유도분화 과정 중 신경전구세포 단계에서 신경전구세포의 이질 혼합성을 발견하였음. 신경전구세포를 확보하기 위해 발생과정의 신경외배엽 발생을 근거로 하여 신경전구세포 이외에 포함될 수밖에 없는 신경능선세포의 존재를 파악하고 신경전구세포의 동질성을 확보하기 위하여 신경능선세포를 분리시켜 배제하고자 함.
그림50
발생과정 중 신경외배엽을 구성하는 신경전구세포를 세포표면 단백질인 PSA-NCAM을 표적으로 하여 분리시 양성세포는 신경전구세포의 형태를, 음성세포는 신경능선세포 형태를 보였으며 (왼쪽) 그것을 수치화하였음 (오른쪽)
경전구세포의 이질 혼합성을 당단백질인 PSA-NCAM (polysialylated neuronal cell adhesion molecule)을 이용한 분리로 확인하였고, PSA-NCAM 음성세포인 신경능선세포를 분리하여 제거함으로써 중배엽성 종양 및 의도하지 않은 세포의 이식을 억제하였음. 이렇게 신경전구세포로의 분화 과정 중 발생할 수 있는 신경능선세포를 분리하여 제거함으로써 이식 시 안전한 세포를 확보하였으며, 이 세포를 척수손상에 적용하기 위한 연구를 진행함.
그림51
도파민신경전구세포가 아닌 타 세포로의 분화 가능성이 없음을 확인
PSA-NCAM 음성세포에서 신경능선세포의 특징을 확인하기 위하여 신경능선세포의 전형적인 마커인 p75, Hnk1, 그리고 AP2의 발현을 확인하고, 전구세포의 특징인 증식 능력을 Ki67로 관찰하였으며, 또한 미분화 세포의 존재의 확인을 위해 SSEA4 발현 여부를 확인하였으나 발현하지 않음을 확인.
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